在缺氧環境中，活性污泥中的部分細菌，如變形桿菌、微球菌屬、芽孢桿菌、產堿桿菌等會改變其呼吸方式，從有氧方式轉換為兼氧呼吸方式，以維持其生命活動；同時將硝態氮轉化為氮氣或氮氧化物。這種轉化過程稱之為反硝化過程，而將硝態氮轉化為氮氣或氮氧化物的細菌稱之為反硝化菌，轉化過程如下：

在pH為中性至弱堿性的厭氧環境中，氮氣（N2）是主要產物；在低pH和高溶解氧的環境中，一氧化二氮（N2O）是主要產物；由于二沉池水中的溶解氧濃度非常低，因此也有類似反應并導致浮泥，這就是常見的反硝化浮泥。

另外，無論在缺氧區還是在好氧區，由于微生物的細胞合成會直接將氨氮或者將硝態氮轉化成氨氮后用于構成細胞物質，也可以降低廢水中氮的含量，這就是大家所說的同化過程。

相對于硝化過程，反硝化過程的控制較為簡單，其要點主要如下：

1.溶解氧：當水中的溶解氧濃度高于0.2mg/l時，反硝化反應會受到影響，故需要在缺氧池維持溶解氧濃度<0.2mg/l。這與混合液回流量有直接關系，當溶解氧偏高時，需要適當降低混合液回流量。

2.溫度：反硝化菌的適宜溫度與硝化菌基本相同，上限溫度可以耐受到40℃。反硝化反應的速率隨著溫度的上升而增加，所以若水溫偏低，則需要更大容積的缺氧區。

3.碳源：反硝化菌為異養型細菌，以有機碳作為碳源，也就是說反硝化反應需要碳源參與反應。理論上每還原1g NO3-N，需要消耗2.86g有機碳，這一點非常重要，通常必須維持缺氧池進水BOD/TKN>3，才能保證反硝化反應的充分進行，否則需要考慮額外補充碳源。